三级生物安全柜提供一级,二级安全柜无法提供的安全保障。所有三级生物安全柜都是,并且采用完全密闭设计。实验操作完全通过前窗的手套进行。在日常操作过程中,安全柜内部将一直保持负压状态。即使在物理防污染系统出现故障的情况下,它也能。

所有三级生物安全柜经HEPA过滤器过滤后的洁净空气产品保护,并且防止样品交叉污染的情况出现。废气通常经由HEPA过滤。或者将两个HEPA过滤器并排使用。实验所需的物品同过安置在安全柜侧面的隔离通道送进柜内。三级安全柜通常直接将废气排到实验室。然而,空气也可以通过外接的排气管道直接排到外界环境。当使用排气管道系统的时候,三级安全柜也适用于在试验中需要添加有毒化学品的微生物操作。所有三级生物安全柜都可在涉及一,二,三,四级生物安全水平的微生物因子实验中使用。